【摘要】：自然杀伤细胞(NK细胞)是固有免疫系统中的一种重要细胞,在抗病毒、抗肿瘤过程中发挥着重要作用。在造血干细胞移植过程中,NK细胞是最早出现的免疫细胞,发挥着重要的抗白血病细胞效应,而且不会引发机体移植物抗宿主病。因此,NK细胞在白血病过继转输治疗方面具有重要的应用前景。体外扩增大量功能性NK细胞并获得有效的治疗效果是目前NK细胞临床应用研究的热点。就这些问题,我们进行了相关的实验,得到以下结果:1、通过采用脐血CD34+干细胞,应用不同的细胞因子组合使其最终分化为NK细胞。经过五周的培养,NK细胞的比例可达到90%以上nk细胞,扩增约7000倍。通过对不同阶段培养细胞差异表达的基因进行聚类及相关性分析nk细胞,我们发现前三周细胞和后两周细胞之间的基因表达有明显不同,根据这一现象,我们将NK细胞的体外分化过程分别命名为程序一和程序二。2、对已报道的转录因子进行检测,发现程序二的细胞与原代NK细胞具有相似的转录因子表达谱,表明所培养的细胞可以作为研究NK细胞发育分化的体外模型。进而对两个分化阶段的细胞进行差异表达的转录因子分析,我们发现程序一的细胞主要聚集锌指结构域的转录因子,而程序二的细胞主要聚集基础结构域家族和螺旋-转向-螺旋结构域家族的转录因子。
对相应的转录因子进行分析,表明程序一为NK细胞前体,程序二调控NK细胞的转化以及功能成熟。3、对不同阶段培养细胞的趋化因子受体及细胞因子受体表达谱进行分析,我们发现程序二,即分化的NK细胞表达相对高水平的NK细胞功能相关受体,表明此细胞具有发挥相应NK细胞活化及杀伤功能的潜能。4、随后我们对不同阶段细胞杀伤性分子的表达进行分析检测,同样发现分化的NK细胞表达更高水平的炎性细胞因子及杀伤相关的功能分子,并且该细胞具有较强的细胞杀伤活性。5、对所做的芯片进行深层次的挖掘,我们发现分化的NK细胞表达大量的SLAM家族的受体,包括CD244、CD48、CRACC和NTBA。具有较强杀伤功能的外周血NK及脐带血NK细胞高表达以上的SLAM家族受体。并且,培养的细胞表达有SAP和EAT-2,确保SLAM家族受体可以传递活化性信号。6、通过RT-PCR和流式细胞术进行检测,我们发现血液系统肿瘤细胞系相较于实体瘤细胞系,表达更高水平的SLAM家族对应配体,CD48、CD244、CRACC和NTBA。同样的,临床白血病病人的白血病细胞也有相应配体的表达,提示NK细胞可通过SLAM家族受配体的相互作用更有效杀伤白血病细胞。
7、应用过表达或干扰SLAM家族配体的细胞进行细胞结合和杀伤实验,我们发现SLAM家族受配体的相互作用可以促进NK细胞与靶细胞的结合及促进其对靶细胞的杀伤。对临床白血病病人SLAM家族配体的表达水平与NK细胞的杀伤能力进行检测,发现白血病细胞上SLAM家族配体表达水平越高,NK细胞的杀伤能力越强。结合上述的实验结果,我们建立了一个体外大规模分化扩增NK细胞的体系,并且发现在NK细胞的发育分化过程中,无论在转录因子、细胞受体及功能方面都有明显的分区,存在一种程序性的分化模式。对分化的NK细胞进行检测,发现其表面表达较高水平的SLAM家族受体,与之相对应的白血病细胞上表达相应的配体,并且该受配体的存在可明显增强NK细胞与靶细胞的结合,及促进NK细胞对靶细胞的杀伤。上述结果提示NK细胞在白血病过继转输中有更好的治疗效果,并且白血病细胞表面SLAM家族配体的表达可作为NK细胞治疗有效性的潜在预测指标。
