NK细胞的输液方法健管院二病区 前言随着现代生物学研究的不断突破，把生命 科学推进一个黄金时代。虽然很多方面尚 处于初级阶段，但已让人们满怀期待。此 时此刻，任何科研型的临床医生都不会置 身其外，漠视这个时代遍地的创新机会。 免疫细胞治疗就是其中的一个研究热点。 抗癌免疫细胞进化史 美国研究人员早在1985年就首次取患者的自身淋巴细胞，在实验室 中通过IL-2 反复诱导细胞增殖，制备出大量杀伤性淋巴细胞，即LAK 细胞，回输给黑色素瘤患者，开辟了免疫治疗肿瘤的新途径。 但由于T细胞体外增殖效率不高，体内杀瘤活性不强，且部分患者出 现副反应，所以最终淡出临床。 于是，上世纪90 年代人们想到了抗原呈递细胞。树突状细胞 （DC），是体内最有效的辅佐T 细胞的抗原呈递细胞。在免疫应答 起始阶段，伤害人体的外来抗原进入体内，但T 细胞上的受体只能识 别一部分抗原，此时呈递细胞捕获未被识别的抗原，传递给T 细胞， 发生免疫反应，从而杀伤外来抗原。 相比之下，在肿瘤细胞的发生、发展过程中，作为固有免疫系统的重要组成细胞——自然杀伤细胞（NK），不仅可以直接杀伤肿瘤细胞， 还可以分泌细胞因子调节免疫细胞，进而在抗肿瘤免疫中发挥重要作 用，这时又一种新型免疫细胞——NKT 细胞进入专家的视野：其既具 有NK 的功能，能直接杀伤肿瘤和病毒细胞，有良好的免疫调节作用， 又有抗原呈递功能，大大提高了杀伤肿瘤的能力。
免疫细胞的优点 细胞免疫治疗的优点是创伤小，病人易接受，相对安全，费用也能让普通人接受。从理论上 讲，该方法符合个体化、绿色治疗的特征，即把个体自身的细胞从外周血提取出来，在体外经过 激活、扩增，然后再回输到体内，杀灭体内的外来抗原。在实际操作中，这项技术也不复杂，回 输途径有多种。但是，在提取、实验室培养、回输整个过程中，要求严格的无菌操作，所以对实 验室安全要求非常高。在这方面国家应出台相关操作规范和实验室标准，严格管理。 用于移植治疗的细胞的种类 主要有肝细胞、胰岛细胞、树突状细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞、淋巴因子激活 的杀伤细胞、胚胎干细胞、造血干细胞、 间充质干细胞等，每种细胞都有不同的生 物学特性。 用于移植治疗的细胞的种类 1．1．1肝细胞肝脏是由肝细胞组成。用于移植的肝细胞肿瘤包括:第一，异种肝细胞。目前最常用的是猪肝，它能提供与人肝结构相似、功能相近的肝 细胞。Nishitai等在免疫缺陷鼠的脾脏内移植猪肝细胞，发现新鲜分离的猪肝 细胞较之培养后，4保存或冻存后的猪肝细胞在移植后具有更好的活力和分 泌功能。提示新鲜分离的猪肝细胞是首选的异种肝细胞源。第二，成熟的人 肝细胞。
这是最理想的细胞来源。第三，胎肝细胞。胎肝细胞是由流产胎儿 肝脏分离所得的肝细胞及其前体具有分化增殖能力强、免疫原性弱及更能抵 抗低温贮存损伤等优点。第四，永生化肝细胞株。国内有学者以重组质粒 SV40LT/pcDNA3．1经脂质体转染来源于正常人肝细胞，成功构建水生化人 源性肝细胞系HepLL，研究表明HepLL具有正常人肝细胞的形态特征和生物 学功能［2-3］。 1．1．2胰岛细胞胰岛是由数十～数千个细胞组成的细胞团。按染色和形态学特点，人胰岛细胞主要分为A(α)细胞、B(β)细胞、D细胞和PP细胞。A细胞约 占胰胰岛细胞的20%，分泌胰高血糖素，升高血糖;B细胞占胰岛细胞的 60%～70%，分泌胰岛素，降低血糖;D细胞占胰岛细胞的10%，分泌生长激 素抑制激素;PP细胞数量很少，分泌胰多肽。其中β细胞是治疗糖尿病的功能 细胞，主要分布于胰岛中心部位，可将胰岛细胞从胰岛组织中用胶原酶等消 化并分离出来治疗糖尿病。 1．2．1树突状细胞树突状细胞(dendriticcell，DC)是一种高效杀伤活性的异质性细胞群，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%，不具有吞噬能力，但能够摄取、加工和呈递抗原，刺激体内的初 始型T细胞活化，启动机体免疫应答，因而是一种抗原呈递细胞。
此外DC还可以通过直接或间接方 式促进B细胞的增殖与活化，调控体液免疫应答;刺激记忆T细胞活化从而诱导再次免疫应答。DC经 体外大量扩增后，具有显著杀伤肿瘤和清除病毒活性，在机体的细胞免疫和体液免疫中起重要的调 控作用。DC细胞疗法的过程是取患者自身的单个核细胞在体外活化、增殖后，然后再转输入患者 体内，诱导机体产生特异性或非特异性的免疫应答，在患者体内发挥抗肿瘤和抗病毒作用［4］。 1．2．2细胞因子诱导的杀伤细胞细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkillercell，CIK)是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间 后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子，故又被称为NK细 胞样T淋巴细胞。CIK细胞能以不同的机制识别肿瘤细胞，通过直接的细胞质颗粒穿透封闭的肿瘤细 胞膜进行胞吐．实现对肿瘤细胞的裂解;通过诱导肿瘤细胞凋亡杀伤肿瘤细胞;CIK细胞分泌IL-2，IL- 6，IFN-γ等多种抗肿瘤的细胞因子;CIK细胞回输后可以激活机体免疫系统，提高机体的免疫功能 1．2．3淋巴因子激活的杀伤细胞淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokineactivatedkillercell，LAK)不是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细胞体外培养时在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为 能够杀伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞。
LAK有广谱抗瘤作用，与IL-2合用的效果比较好，将外周 血淋巴细胞在体外经淋巴因子白介素-2(IL-2)激活3～5d而扩增的细胞群，经淋巴管途径回输的LAK 细胞直接到达次级淋巴器官，并在IL-2的作用下继续增殖、成熟，并保持活性，使得能到达肿瘤组 织的细胞数较多，且持续更长，因此杀伤力有力增强。LAK细胞的来源充足，效果肯定，发热副作 用轻微。 1．3．1胚胎干细胞胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)是早期胚胎(原肠胚期之前)或原始性腺种分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESC具有多能性(pluripotency)，特点是可以通 过细胞分化成多种组织(所有组织nk细胞，包括生殖系细胞)的能力，但无法独自发育成一个个体(利用四倍体融合技术可以 得到完全由所用ESC发育而来的个体)［7］。成人干细胞能否保有万能分化性，直到现在仍有争议。不过，已有研 究发现，多能干细胞可以从成纤维细胞等很多细胞中产生出来，这也就是目前很热的诱导性多能干细胞 (inducedpluripotentstemcell，iPScell)，目前越来越多的数据显示这种多能干细胞和胚胎干细胞还是存在很大差异的 ［8］。
人胚胎干细胞的分离和体外培养成功具有极其重要的研究和临床应用价值，其可用于体外研究人类胚胎发 生发育的过程，有助于理解分化发育的机制、认识生命和疾病的现象。通过对人胚胎干细胞体外分化和定向分化的 研究，可识别某些靶基因，为人类新基因的发现及其功能的研究提供新方法。人胚胎干细胞最为深远的潜在用途是 通过定向分化诱导产生各种特化的细胞和组织，将其用来修复或替换丧失功能的组织和器官，从而治疗许多疾病， 如帕金森病、老年痴呆症、脊髓损伤、脑卒中、烧伤、心脏病、糖尿病、白血病、骨关节炎等。经过遗传工程改造 的人胚胎干细胞，还可为人类疾病的基因治疗开辟更广泛的应用前景。 1．3．2造血干细胞造血干细胞(hemopoieticstemcell，HSC)是一种存在于骨髓中的干细胞，具有自我更新能力，能分化成各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其 他细胞。造血干细胞由于具有良好的分化增殖能力，可以救助很多患有血液病的人们，最常见的就是白血病。但其 配型成功率相对较低，且费用高昂。捐献造血干细胞对捐献者的身体并无很大伤害。 1．3．3骨髓间充质干细胞在骨髓中，除含有造血干细胞外，还含有少量间充质干细胞。
早在1987，Friedenstein报道培养在塑料培养皿中贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞， 并且这些细胞经过20～30个培养周期，仍能保持多向分化潜能，被称为骨髓间充质干细胞(bonemarrow- derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)。针对骨髓充质干细胞成骨、成软骨的培养诱导条件进行优化，研究其在 骨和软骨损伤中应用的研究已显示出良好的前景。近年来还证实骨髓间充质干细胞在动物体内可以参与损伤肌组织 的再生和形成星形神经胶质细胞，可用于这些组织器官相关疾病的治疗。 细胞移植治疗的疗效和安全性 肝细胞移植的优点和疗效是:第一，创伤对受体的打击相对较小，易操作，安全性好;第二，可部分解决供体短缺的问题;第三，排异反应相对较低;第四，植入的肝细胞能较快地发挥合成、解毒和促进胆红素排泄等作用;第五，可通 过复杂的体液分子机制，促进宿主残余肝细胞增殖和肝功能的恢复;第六，肝脏随着肝细胞的再生而发挥其正常功能; 第七，具有基因修饰的可能性［10］。胰岛细胞移植的主要适应症包括绝大多数1型糖尿病、无胰岛素抗体和低水 平C肽2型糖尿病、糖尿病肾病、器官移植后糖尿病、胰腺疾病或胰腺切除导致的糖尿病等。
加拿大亚伯达大学胰岛 细胞移植专家JamesShapiro研究了加拿大、美国及欧洲9个糖尿病研究中心的36名成年糖尿病患者，年龄从23～59 岁，均已患1型糖尿病多年。每名病人接受1～3次胰岛细胞移植。胰岛素细胞取自自愿捐献器官的人体。为防止发 生排斥现象，病人还需服食新一代抗排斥药物。胰岛素细胞植入1年后，有16名病人不再需要注射胰岛素，其他10 人体内胰岛素生成功能部分恢复。移植的胰岛细胞在70%的案例中能继续制造胰岛素，但胰岛细胞移植对部分病人 功效并不显著，他们仍须补充少量胰岛素。迄今接受胰岛细胞移植的1型糖尿病人只有不到三分之一能维持两年不 靠注射补充胰岛素。 2．1．2免疫细胞自体免疫细胞可用于恶性黑色素瘤、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、喉癌、鼻咽癌、胰腺癌、肝癌、胃癌等实体瘤手术后防止复发，也可用于多发性骨髓瘤、B淋 巴瘤和白血病等血液系统恶性肿瘤的复发，但不适用于T细胞淋巴瘤患者、器官移植后长期使用免疫抑制药物和正 在使用免疫抑制药物的自身免疫病的患者。自体细胞免疫疗法对某些恶性肿瘤的疗效显著，尤其对于不适合做手术、 放化疗的恶性肿瘤病人来说是首选治疗方案，能有效降低放化疗的副作用，防止肿瘤转移、复发。
自体细胞免疫疗 法治疗病毒性疾病，可打破病毒的免疫耐受，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化来延缓肝脏失代偿、肝硬化、肝癌的 发生，从而改善生活质量和生存期，乙肝病毒转阴率高达80%。 2．1．3干细胞干细胞可治疗的疾病种类很多，包括脊髓损伤、各种类型的孤独症、脑中风、脑血栓、格林巴利综合征、小脑萎缩、运动神经元病、脉管炎、糖尿病、股骨头缺血坏死、尿毒症、肝硬化、进行性肌营养不良、心功能衰竭、扩张性心肌病、系统性红斑狼疮、严重 类风湿、系统性硬化症、脊髓侧索硬化症、多发性肌炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎(克隆氏病)、糖尿病、再生障碍性贫血、哮喘、淋巴 水肿、丝虫病、乳癌术后放疗、下肢深静脉血栓等。 脊髓损伤导致四肢瘫痪或双下肢瘫痪及外伤性脑组织缺损，干细胞治疗可使病人的感觉、运动和大小便功能得到一定程度的恢复，并且，颈脊髓损伤的疗效明显优于胸脊髓损伤。干细胞治疗适用于各种类型的孤独症，但最好在发育期之前进行，这样细胞的成长也更为迅速， 成熟的也较早，治疗效果会更好。一旦过了青春期，每向后推迟5年，临床治愈率就会递减10%以上，而30岁之后的孤独症患者，疗效虽然 也有明显改善，但治疗期很可能会长达5年左右［11］。
脑中风、脑血栓、脑瘫、格林巴利综合征、小脑萎缩、运动神经元病等，干细胞治 疗后能改善病人的肌力、降低肌张力、增进肢体协调性、改善病人吞咽困难和失语等症状。脉管炎、糖尿病造成的下肢动脉闭塞症性缺血 病人，如果下肢尚没有完全缺血坏死(没有形成坏疽、溃烂、肢体变黑，足背动脉摸不到不是禁忌症)，干细胞治疗后可迅速恢复下肢动脉 血供，保肢成功率较高，可避免截肢造成病人残疾。股骨头缺血坏死的年轻病人(一般小于60岁)，如果股骨头没有塌陷或轻度塌陷，干细 胞治疗后保头成功率很高，而以往各种单纯减压植骨、血管植入、肌骨瓣植入、腓骨移植等手术晚期塌陷率很高(不能再生血管网和骨组 织)，而人工全髋置换术关节假体使用年限短、磨损、碎屑刺激引起疼痛、病人术后20年左右还得接受二次人工关节翻修术［12］。心功能 衰竭、扩张性心肌病、房颤、各种早搏、肺心病、陈旧性心肌梗塞、室壁瘤等病人，不适合或不愿意安放支架或不愿意接受开胸心脏搭桥 手术的病人，治疗后可促进心脏狭窄或闭塞的动脉血管重新开放，促进侧枝循环再生或开放，促进心肌血管和心肌再生，纠正异常心律， 明显改善心功能和临床症状。多次手术骨折不愈合、骨不连、骨折延迟愈合的病人，干细胞治疗后骨折愈合较迅速，成功率高，该手术不 开刀，仅穿刺数针，病人痛苦小。
患进行性肌营养不良的先天性遗传病患儿干细胞治疗后可明显增强病儿的四肢肌力，明显改善步态和生 活自理能力。干细胞对哮喘出现的咳嗽、多痰、胸闷等症状有明显的治疗作用。具有疗效快、疗程短、不易复发等优点，突破了以往“治 疗见效———停药复发”的弊端。临床证实，干细胞免疫疗法对哮喘出现的咳嗽、多痰、胸闷等症状有明显的治疗作用。针对哮喘病特性 经过细胞培养实验室特殊培养的干细胞，可以修复呼吸系统损伤，激活肺部细胞再生，全面调理肺部，激活肺部细胞再生修复肺通气功能 ［13］。尿毒症早、中期的病人，如果肾脏没有明显萎缩(一般不小于正常肾脏大小的1/3)，干细胞治疗后可促进肾脏滤过系统再生，明显 增加尿量、降低血液肌酐和尿素氮水平，减少血液透析的次数，同时纠正肾性贫血、胃肠道等症状。肝硬化病人干细胞治疗后可明显改善 肝功能nk细胞，黄疸、腹水减轻或消退，食欲增加，体质、精神状态明显改善，白蛋白升高，转氨酶下降。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、 严重类风湿、系统性硬化症、脊髓侧索硬化症、多发性肌炎、多发性硬化等，干细胞治疗后症状明显减轻，病情缓解时间较长或治愈，相 比应用免疫抑制剂或化疗药物副作用极小，可以忽略不计。
用于抗衰老时，干细胞可明显改善衰老状态、消除多余脂肪、减少面部皱纹、 面色更红润、年轻，改善女性更年期症状、改善睡眠，月经更规律，减轻痛经。男性提高性功能，减少腹部多余脂肪，肌肉更加结实，皮 肤更有弹性，接近年轻时状态。淋巴水肿、丝虫病、乳癌术后放疗常造成下肢、上肢肿胀，干细胞治疗后再生淋巴管，肿胀消退较明显。 下肢深静脉血栓，干细胞治疗后再生血管网，促进回流，减轻下肢肿胀。1型或2型糖尿病肝细胞治疗后血糖下降较明显，部分病人可停用 胰岛素及降糖药物。此外，肾脏移植手术病人干细胞治疗后可明显减少免疫排斥反应，溃疡性结肠炎干细胞治疗后脓血便等临床症状明显 缓解、结肠镜检查溃疡面愈合较好，再生障碍性贫血干细胞治疗后可明显改善骨髓造血功能、改善贫血状态。 细胞移植治疗的禁忌症及安全性 2．2．1普通体细胞普通体细胞治疗在临床上具有较高的安全性，但存在禁忌症。肝细胞移植的禁忌症主要包括严重败血症、不可逆的神经症状、有临床症状的心脏病和其 它严重先天性畸形、肺(血管)分流、或肝外恶性肿瘤(有治愈可能的除外)。另外血管异 常、家庭或环境差、精神异常者属于相对禁忌症。肝细胞移植是安全的，但要注意控 制排异反应。
患有不可根治的肿瘤和精神病是胰岛细胞移植的禁忌症，任何急性病无 论与糖尿病是否有关，都应在移植前治疗和处理，特别要注意治疗感染性疾病，受者 的年龄上限一般不超过60岁。但随着适应证的拓宽，其禁忌证也在不断改变，如受体 年龄的限制等［14］。 2．2．2免疫细胞免疫细胞治疗肿瘤在临床上是安全可靠的。该方法的禁忌症包括:高度过敏体质或者有严重过敏史者;休克或全身衰竭生命体征不正常及不配合检查者;全身 感染或局部严重感染需抗感染康复后;合并心、肺、肝、肾等重要脏器的功能障碍;凝血 功能障碍如血友病、血清学检查阳性者如艾滋病、乙肝、梅毒等;染色体或基因缺陷;怀 孕或哺乳期妇女;脏器移植者;严重自身免疫性疾病患者;对本治疗中所用生物制剂过敏 者;T细胞淋巴瘤等［15］。 2．2．3干细胞大量临床研究和治疗病例表明，干细胞移植治疗除极少数患者有轻微发热、头痛外，无其他严重不良反应，其临床应用是安全的，但有一些病人暂时还不宜 进行干细胞治疗，包括休克或全身衰竭生命体征不正常及不配合检查者;晚期恶性肿瘤， 尤其是脑肿瘤患者;全身感染或局部严重感染抗感染康复前;合并心、肺、肝、肾等重要 脏器功能障碍者;凝血功能障碍;血清学检查(如艾滋病、乙肝、梅毒等)阳性;非神经系统 疾患或尚未明确诊断者;高度过敏体质或有严重过敏史者。
NK细胞 自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK细胞)是骨髓来源的大颗粒淋巴细胞，约占人外周 血淋巴细胞总数的5%～10%。NK细胞能分 泌细胞因子和趋化因子，是机体天然免疫 的主要承担者，也是获得性细胞免疫的核 心调节细胞，在肿瘤免疫、抗病毒感染及 清除非己细胞中发挥重要作用［6］。 NK 细胞免疫疗法适用范围 （可与放化疗技术同时使用）抗癌免疫细胞进化史 人体免疫细胞包括白细胞和淋巴细胞；淋巴 细胞主要包括由胸腺产生的杀伤性T 细胞、 由骨髓分化而来的B 细胞、自然杀伤细胞 （NK）以及新近发现的NKT 细胞。人们初 的想法很简单，就是让最直接的杀伤武 细胞和白细胞消灭入侵的外来抗原。围采血期护理 治疗前1周内停用严重损伤免疫功能的药物,每日肌注射胸腺肽1 晨静脉采血前前嘱患者放松,采血过程中注 意患者有无头昏、乏力、心慌等不适, 采取 40 l静脉血后分别放入4个抗凝试管,尽快 送实验室进行培养; NK细胞培养约需14 期间加强心理疏导,嘱患者多休息、多增加 营养摄入, 保持稳定情绪, 增强治疗信心。 发热的护理 NK细胞回输所致发热一般症状比较轻微、短 呈一过性,体温大多在38. 以下,一般 不需要特殊处理体温。
本例患者共进行3次 NK细胞免疫治疗, 第2次治疗2 h后体温升高 至37. 给予持续心电监护、加强体温监测、嘱患者多饮开水及改善通风, 患者于4 后体温恢复正常。饮食护理 在保持足够营养、热量的基础上, 嘱患者尽量 食用松软、易消化吸收的食物, 慎食辛辣、 寒凉食物。 NK 细胞回输过 程中的护理 选择较粗直的血管, 以24号套管针建立静脉通道, 以免NK 细胞在针头局部聚集或破坏; 采用一次性 输血器, 用生理盐水冲管后输注NK细胞悬液, 液体 滴速开始控制在40滴/m in后逐渐增加至60滴/m l的细胞悬液在30~60 毕较为适宜,滴速太快细胞有阻塞微小血管的危险, 太慢则有可能降低细胞活性; 回输过程中密切观察 患者病情变化, 注意有无寒战、发热、心慌、胸闷、 呼吸困难等不适及皮肤黏膜有无皮疹、瘙痒等, 现异常立即通知医生对症处理;NK细胞滴毕后用 生理盐水冲管, 避免和其他药液混合; 嘱患者回输 完毕6 h内不可洗澡, 防止发热。
