背景：
NK 细胞是一群较大的颗粒化的淋巴细胞，其细胞表面表达 CD56 且缺少 CD3 的表达，所以，通常用表面标志 CD3‐ CD56+ 来界定 NK 细胞。 NK 细胞大约可以占到外周血淋巴细胞的5‐15%，同时分布在人体肝脏、骨髓和淋巴结等部位。
NK 细胞是固有免疫系统重要的组成部分，可以通过多种方式对肿瘤细胞或受感染细胞造成杀伤：
1）与靶细胞接触后，释放穿孔素和颗粒酶；
2）通过自身表达的配体，刺激并活化靶细胞表面的死亡受体；
3）通过抗体依赖的细胞毒作用对靶细胞造成杀伤。
由于 NK 细胞对肿瘤细胞或受感染细胞可以做出快速的免疫反应，所以在机体的免疫监视中发挥重要的作用。有研究表明， NK 细胞不足的患者更容易受到严重的系统性病毒感染。外周血中 NK 细胞活性高的男性患肿瘤的几率要低 10%，而在女性中这一数值是4%。同时 NK 细胞不需要特异性的抗原刺激，即可对肿瘤细胞造成杀伤的特性，使其在临床上获得了广泛的应用，并取得了一定的疗效。但是nk细胞，无法在体外培养获得足够数量的高纯度 NK 细胞，成为了进一步提高临床治疗效果的瓶颈。
培养原理：
本技术提供一种 NK 细胞的高效制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高 NK 细胞的增值速度和纯度。
将 NCR3LG1 基因转染到饲养细胞中后，可以刺激活化 NK 细胞nk细胞，使其快速增殖，而且它与膜表达的 m IL-15对 NK 细胞的刺激有协同作用，所以将 IL-15和 NCR3LG1同时转染到 K562 细胞中后，作为饲养细胞刺激活化 NK 细胞，同时添加 IL-2和 IL-21 细胞因子，极大的提高了培养 NK 细胞的效率。
细胞制备：
1）外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞 50-100 mL；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞（PBMC）；
1.3 无血清培养液洗涤 2 次，获得纯度在 90% 以上的 PBMC。
2）NK 细胞的培养及鉴定
将从外周血分离得到的 PBMC 用培养液重悬后，接种培养瓶中，同时添加 IL‐2 和 IL‐21 因子进行刺激培养；
第二天，添加 NK-2， NK-3， NK-4 三种因子（华奥生物根据饲养层细胞 K562 分泌的因子配制而成的，有效避免饲养层细胞回输安全隐患）
培养 4 天后，将细胞转移到透气的细胞培养袋中继续扩大培养。
持续扩大培养至第 21 天，收获细胞，完成 NK 细胞的制备
3）NK 细胞质控
3.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在 80% 以上；
3.2 流式细胞仪检测细胞表面 CD3、 CD8、 CD56等分子的表达： CD3- CD56+细胞的比例应在80%以上。
3.3 细胞杀伤实验：以 NK 细胞为效应细胞，以肿瘤细胞（可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株）为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按 10 : 1（数目比） 的比例加入 96 孔 U 型板中，每孔含靶细胞 1 x 104 个，终体积为 200 ml，设 3 个复孔。培养 4 h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶（LDH） 试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率
3.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素（标准：病原学检测阴性，内毒素
推荐试剂：
生产商
产品名称
产品规格
南京华奥生物技术有限公司
NK-2试剂
500ul
南京华奥生物技术有限公司
NK-3试剂
250ul
南京华奥生物技术有限公司
NK-4试剂
500ul
